Ponente
Descripción
Introducción. Las coagulopatías hereditarias más frecuentes son; la hemofilia A (déficit del factor VIII), la hemofilia B (déficit del factor IX) y la enfermedad de von Willebrand (EVW). La hemofilia A (HA) y la hemofilia B (HB) son enfermedades recesivas ligadas al cromosoma X que afectan a 1 en 5000 y 1 en 30.000 varones respectivamente, producidas por mutaciones en los genes F8 y F9. Las mujeres pueden ser portadoras asintomáticas o pueden presentar síntomas leves o moderados. La EVW muestra un patrón de herencia autosómico dominante o recesivo, sin predilección por el sexo; sin embargo, las mujeres pueden presentar síntomas producto de la menstruación. En ella se altera cualitativa o cuantitativamente el Factor de von Willebrand (vWF) y afecta aproximadamente al 1 % de la población general. Las mutaciones más frecuentes en los casos de HA severa son las inversiones de los intrones 1 o 22, por otra parte, se han descrito más de 3000 mutaciones en el F8 que incluyen todos los tipos de severidad, en el gen F9 y vWF se ha descrito un espectro muy variado de variantes patogénicas, desde inserciones y deleciones pequeñas y grandes, mutaciones nonsense y missense. La detección de las mutaciones causales de los principales trastornos de la coagulación sanguínea permite un seguimiento adecuado del paciente, posibilita la detección de portadoras y permite conocer la distribución de las mutaciones en la población. El objetivo de este trabajo fue poner a punto un algoritmo de diagnóstico para detectar las mutaciones causales de las principales coagulopatías hereditarias.
Metodología. Se estudiaron 15 individuos, 12 pacientes con diagnóstico previo: 8 HA severa, 2 HA leve, 1 HA moderada, 1 HB moderada y tres mujeres posibles portadoras, de la población de Tacuarembó y de Rivera. Los pacientes fueron diagnosticados en el Hospital Regional de Tacuarembó y en el Hospital Departamental de Rivera. Bajo consentimiento informado se obtuvo una muestra sanguínea para la extracción de ADN por el método salino.
El primer paso del algoritmo de diagnóstico fue el estudio de las inversiones del intrón 1 y 22 aplicando las pruebas de inverse shifting-PCR (IS-PCR) (Rossetti LC et al., 2008) a los pacientes con HA severa, posteriormente, los pacientes negativos para las inversiones y todos los pacientes con HB y EVW, fueron estudiados por secuenciación masiva paralela (SMP) con un panel de genes de diseño propio creado desde la plataforma DesignStudio de Illumina® para secuenciar las regiones codificantes de los genes F8, F9 y vWF. Se elaboraron las librerías genómicas con el protocolo AmpliSeqTM Illumina®, se verificaron con el sistema Fragment AnalyzerTM, por un método fluorométrico (QubitTM), se cuantificaron y se secuenciaron con el Miniseq de Illumina® en la Plataforma Genómica de la Facultad de Ciencias-UdelaR. Fue creado un flujo de trabajo con el programa Geneious Prime® para mapear las secuencias obtenidas con los genes de referencia y las variantes encontradas fueron revisadas en las bases de datos: HGMD, LOVD, gnomAD y ClinVar. Posteriormente las variantes patogénicas encontradas por SMP fueron confirmadas por secuenciación Sanger.
Resultados y conclusión. 3 de los 8 pacientes con HA severa resultaron positivos para las Inversiones (1 para la Inversión del intrón 22 y 2 para la inversión del intrón 1), por su parte en 4 de los 5 pacientes con HA severa negativos para las inversiones se detectaron 4 diferentes variantes patogénicas en el F8, entre las cuales se encuentran: 3 inserciones pequeñas y 1 mutación nonsense: c.3637_3638insA, p.Ile593Argfs12, p.S806Pfs6 y cDNA.244C>T respectivamente. En contraste, en 1 paciente con HA severa no se detectaron variantes patogénicas. Con respecto a los pacientes con HA leve, en 1 paciente se detectó la mutación p.R854Q del gen vWF en estado heterocigota y en otro paciente la mutación p.V64M, en el paciente con 1 HA moderada se detectó la mutación p.Q2208R. En cuanto al pacientes con HB, moderada fue posible detectar la variante patogénica p.E66K. Sobre las portadoras, se pudo confirmar una portadora con la Inversión del intrón 1, una portadora de la inserción c.3637_3638insA y otra portadora obligada de la mutación nonsense cDNA.244C>T.
En Conclusión, el algoritmo de diagnóstico permitió detectar variantes patogénicas en 11 de los 12 pacientes como causa del trastorno de la coagulación, en el caso de las portadoras, en 3 estudiadas se encontraron las variantes patogénicas en estado de heterocigosis, por lo que el algoritmo de diagnóstico molecular tuvo una eficacia del 93% para la detección de variantes patogénicas en pacientes con hemofilia A y B con diferentes grados de severidad, así como en las portadoras y también permitió la reclasificación de un paciente de HA leve a EVW.
