Ponente
Descripción
Introducción. La hemofilia A (HA) es un trastorno genético hereditario ligado al cromosoma X que afecta al sistema de la coagulación sanguínea, dándose principalmente en los hombres. Se caracteriza por la deficiencia de la actividad del factor VIII (FVIII) de la coagulación, lo que lleva a una mayor tendencia a sufrir hemorragias prolongadas y complicaciones graves. Los fenotipos se clasifican en tres grupos, severos cuando la actividad del FVIII es < 1%, moderados cuando la actividad es entre 1% - 5% y leve cuando la actividad es > 5% - < 40%. Así mismo, el 50% de los casos de HA presentan un fenotipo severo, mientras que el 30%-40% son moderados y el 10% leves. El gen F8 (codificante para el factor FVIII) se encuentra a 1,5 Mb del telómero en el brazo largo del cromosoma X en la región Xq28. Las mutaciones más frecuentes en los casos severos son las inversiones de los intrones 1 o 22, por otra parte, se han descrito más de 3000 mutaciones en el F8 que incluyen todos los tipos de severidad. Desde el año 2020 se comenzó a investigar las causas genéticas de la hemofilia en Uruguay y se puso a punto un protocolo de secuenciación masiva paralela (SMP) para estudiar las zonas codificantes del gen F8, lo que ha permitido la detección de diferentes variantes patogénicas en los pacientes. El objetivo de este estudio fue confirmar las mutaciones obtenidas previamente por SMP y la detectar portadoras por el método de secuenciación Sanger.
Materiales y métodos: Se analizaron cuatro pacientes diagnosticados con HA Severa (HAS) en el Servicio de Hemoterapia del Hospital Regional de Tacuarembó, en el Hospital Departamental de Rivera, también se estudiaron dos portadoras, el ADN genómico se extrajo a partir de muestras de sangre por el método salino, y se obtuvo una concentración promedio de 70 ng/ul. Se amplificaron el exón 12, el exón 13 y un fragmento de 773 pb del exón 14 mediante método de PCR (según protocolo David D. et al., 1994). Los productos obtenidos fueron purificados con un kit comercial (ZYMO research®) y enviados a la empresa Macrogen (Corea del Sur) para su secuenciación. Las secuencias de los pacientes y las portadoras fueron alineadas contra la secuencia de referencia del F8 (NG_011403.2) con el programa Geneious Prime® V-2023.2.1, y las variantes patogénicas encontradas fueron revisadas en las bases de datos HGMD, EAHAD, CHAMP, gnomAD and ClinVar.
Resultados y Conclusiones: En un paciente con HA severa se confirmó la mutación p.Ile539ArgFs*12 la cual consiste en una duplicación de una secuencia de 16 pb en el exón 12. En otro paciente HA severa y su hija como portadora obligatoria (heterocigota), se detectó la mutación missense p.C649S en el exón 13, en dos pacientes no relacionados y la madre de uno de ellos (portadora) se detectó la mutación c.3637_3638insA, que consiste en la inserción de una Adenina en el exón 14 del gen F8. En conclusión, el método de secuenciación Sanger permitió confirmar las mutaciones encontradas previamente por Secuenciación Masiva Paralela y detectar de manera rápida a dos portadoras. Esta información permite el seguimiento adecuado de los pacientes y sus familias, ya que posibilita la detección del estado de portadoras, así como conocer la distribución de las mutaciones en la población en el país.
